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细胞重编程是指将分化细胞在特定的条件下逆转恢复到多能性状态的过程，为再生医学提供干细胞资源。近年来，化学诱导多能干细胞（CiPSCs）摆脱了最初Yamanaka四因子诱导的多能干细胞（iPSCs）对外源基因导入的依赖，开启了对化学诱导重编程认知的新篇章【1，2】。然而到目前为止，CiPSCs仍无法通过干细胞多能性验证“金标准”——四倍体补偿实验证明其拥有与胚胎干细胞（ESCs）和iPSCs类似的发育潜能【3】。精原干细胞（SSCs）是哺乳动物睾丸中的成体干细胞，具有自我更新和精子发生的能力。在体外培养条件下，小鼠SSCs可自发重编程为生殖细胞来源多能干细胞（SSC-iPSCs或gPSCs），是一种独特的重编程现象，但其潜在的细胞命运转变机制不明【4】。
2022年11月17日，南方医科大学赵小阳（中国细胞生物学学会干细胞生物学分会委员）课题组，北京大学BIOPIC中心汤富酬（中国细胞生物学学会理事）课题组和南方医科大学汪妹课题组合作在Protein & Cell杂志上在线发表了题为The Chemical Reprogramming of Unipotent Adult Germ Cells towards Authentic Pluripotency and de novo Establishment of Imprinting的研究论文。该研究利用单细胞转录组测序技术首次系统描绘了小鼠SSCs自发重编程的细胞命运转变路径，针对重编程成功与障碍路径特征进行小分子筛选，建立获得了可以使重编程效率提升约100倍的小分子化合物组合高效诱导体系（5C）。四倍体补偿实验证明5C诱导获得的SSC-iPSCs具有与ESCs类似的发育潜能。重编程机制上，结合单细胞多组学（转录组与DNA甲基化组）测序技术，本文首次发现SSCs重编程反向经过类似体内生殖细胞发育的主要路径，即从精原细胞到原始生殖细胞（PGCs）再到上胚层细胞（Epiblasts）。在此过程中，全基因组和印记基因甲基化状态也同时最终诱导的SSC-iPSCs无论全局DNA甲基化还是印记状态都发生了整体重建，使SSCs这种成体干细胞完全重编程为具有完整发育潜能的多能干细胞获得了类似于ESCs的表观遗传特征。该研究聚焦独特的SSCs自发重编程现象，建立了可修复重编程系统缺陷导致发育障碍的高效诱导体系，其作用机理可能通过调控重编程过程中的关键表观修饰状态来实现，为其他重编程体系的机制研究和再生医学中功能干细胞的获得提供了研究思路。
研究人员首先利用单细胞转录组测序技术绘制了小鼠SSCs重编程的全时程单细胞图谱的细胞变化轨迹，鉴定了1条重编程成功和4条重编程失败的路径，通过比较重编程成功与障碍的路径，通路富集分析发现糖酵解代谢、DNA甲基化/去甲基化等生物学事件特征在与成功重编程路径中显著激活密切相关。随后针对这些特征进行小分子化合物筛选，最终从183个小分子中获得由5个小分子化合物组成的诱导组合（5C，Vitamin C、SGC707、 EGCG、TUDCA、Daphnetin），可将重编程效率显著提高约100倍，并将重编程时程由19天缩短至10天。更让人兴奋的是，由5C诱导获得的SSC-iPSCs在四倍体补偿小鼠出生率、出生小鼠体重及存活率情况方面均优于对照组。进一步通过对不同处理的SSC-iPSCs与ESCs进行DNA甲基化测序，发现5C-gPSCs全局DNA甲基化、印记控制区（ICRs）甲基化、Dlk-Dio3区DNA甲基化水平更接近于ESCs，表明5C小分子组合不仅可以提高SSCs重编程效率，更具有修复多能干细胞表观遗传状态与发育潜能的作用。
为进一步探究5C体系对提升SSC-iPSCs发育潜能提升的调控机制，对该重编程过程中单个细胞的单细胞多组学（转录组和DNA甲基化组同时进行检测）测序发现SSCs重编程早期阶段逆向经过类似体内生殖细胞发育的主要路径，即与精原细胞到PGCs再到Epiblasts的拟发育轨迹高度拟合。这种发育轨迹的拟合不仅体现在成功重编程分支的细胞基因表达水平具有与体内生殖细胞相似的表达特征，还获得了生殖细胞发育过程中典型的全局DNA全基因组及印记基因甲基化擦除与重建的特征。值得一提的是，在重编程过程中，晚期阶段，重编程早期被擦除的全局DNA甲基化获得重建、SSCs部分母源印记基因ICRs特征（Igf2r、Snrpn、Peg3和Peg10等）建立，从哺乳动物雄性生殖细胞SSCs中典型的ICRs双等位低甲基化特征状态经过重编程转变为ESCs样的单等位甲基化状态，且5C小分子处理组高效体系有助于建立更接近于ESCs的全基因组和母源印记基因的甲基化特征在表观重塑方面的优势更加突出，表明该研究建立的高效诱导体系不仅可以提高重编程效率，还具有修复多能干细胞表观遗传障碍与提升其发育潜能的作用。正确的重编程路径及表观特征对重编程诱导至关重要。
综上，研究人员系统解析了独特的SSCs（精原干细胞）自发重编程中的细胞命运转变路径，并利用全新的高效重编程系统修复了SSC-iPSCs的部分发育缺陷。该研究首次揭示了精原干细胞重编程经过类似体内生殖细胞逆发育路径与印记重建的独特机制。
南方医科大学博士生陈雨寒、北京大学博士生卢健森、南方医科大学许言文博士、黄亚萍博士和博士生王大壮为本文的共同第一作者。南方医科大学赵小阳教授、北京大学汤富酬教授和南方医科大学汪妹教授为本文的共同通讯作者。
原文链接：
https://doi.org/10.1093/procel/pwac044
参考文献
1. Hou, P.; Li, Y.; Zhang, X.; Liu, C.; Guan, J.; Li, H.; Zhao, T.; Ye, J.; Yang, W.; Liu, K.; Ge, J.; Xu, J.; Zhang, Q.; Zhao, Y.; Deng, H., Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 2013, 341 (6146), 651-4.
2. Guan, J.; Wang, G.; Wang, J.; Zhang, Z.; Fu, Y.; Cheng, L.; Meng, G.; Lyu, Y.; Zhu, J.; Li, Y.; Wang, Y.; Liuyang, S.; Liu, B.; Yang, Z.; He, H.; Zhong, X.; Chen, Q.; Zhang, X.; Sun, S.; Lai, W.; Shi, Y.; Liu, L.; Wang, L.; Li, C.; Lu, S.; Deng, H., Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature 2022, 605 (7909), 325-331.
3. Zhao, X. Y.; Li, W.; Lv, Z.; Liu, L.; Tong, M.; Hai, T.; Hao, J.; Guo, C. L.; Ma, Q. W.; Wang, L.; Zeng, F.; Zhou, Q., iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 2009, 461 (7260), 86-90.
4. Ko, K.; Tapia, N.; Wu, G.; Kim, J. B.; Bravo, M. J.; Sasse, P.; Glaser, T.; Ruau, D.; Han, D. W.; Greber, B.; Hausdörfer, K.; Sebastiano, V.; Stehling, M.; Fleischmann, B. K.; Brüstle, O.; Zenke, M.; Schöler, H. R., Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell stem cell 2009, 5 (1), 87-96.